Der neue Bischof von Rom wurde am 14. September 1955 in Chicago im US-Bundesstaat Illinois geboren. Er lernte am Kleinen Seminar der Augustiner, danach an der Villanova University in Pennsylvania, wo er 1977 sein Examen in Mathematik und Philosophie ablegte. Im selben Jahr begann er sein Noviziat in der Ordensgemeinschaft der Augustiner (OSA) in St. Louis in der Provinz „Mutter vom Guten Rat“ in Chicago. Am 2. September 1978 legte er seine Erste Profess ab, am 29. August 1981 folgte die Ewige Profess.
An der „Catholic Theological Union“ in Chicago schloss er sein Theologiestudium ab. Im Alter von 27 Jahren wurde er von seinen Vorgesetzten nach Rom geschickt, um an der Päpstlichen Universität St. Thomas von Aquin (Angelicum) Kirchenrecht zu studieren. In Rom wurde er am 19. Juni 1982 im Augustinerkolleg von Santa Monica zum Priester geweiht.
Robert Prevost erhielt 1984 seine Approbation und wurde im folgenden Jahr, während er seine Promotion vorbereitete, in die Augustiner-Mission in Chulucanas im peruanischen Piura entsandt. 1988 begab er sich in die Mission in Trujillo. Dort wirkte er als Leiter des gemeinsamen Ausbildungsprojekts für Augustiner-Aspiranten aus den Vikariaten Chulucanas, Iquitos und Apurímac.
Elf Jahre lang war er Prior der Gemeinschaft (1988-1992), Ausbildungsleiter (1988-1998) und Lehrer der Professen (1992-1998), sowie in der Erzdiözese Trujillo Gerichtsvikar (1989-1998) und Professor für Kirchenrecht, Patristik und Moral im Großen Seminar „San Carlos y San Marcelo“. Gleichzeitig war er mit der pastoralen Betreuung der Pfarrei „Unsere Liebe Frau, Mutter der Kirche“, später St. Rita (1988-1999), in den armen Randbezirken der Stadt betraut. Von 1992 bis 1999 war er auch Administrator der Pfarrei „Unsere Liebe Frau von Monserrat“, ebenfalls in Trujillo.
1999 wurde er zum Provinzialoberen der Augustinerprovinz „Mutter vom Guten Rat“ in Chicago gewählt, zweieinhalb Jahre später wählten ihn seine Mitbrüder auf dem Ordentlichen Generalkapitel des Augustinerordens zum Generalprior. 2007 wurde er für eine zweite Amtszeit bestätigt.
Im Oktober 2013 kehrte er in seine Augustiner-Provinz in Chicago zurück, wo er Ausbildungsleiter im Augustiner-Kloster, Erster Rat und Provinzvikar war; diese Ämter hatte er inne, bis ihn Papst Franziskus am 3. November 2014 zum Apostolischen Administrator der peruanischen Diözese Chiclayo ernannte und als Titularbischof von Sufar in den Stand eines Bischofs erhob.
Er trat am 7. November im Beisein des Apostolischen Nuntius James Patrick Green in die Diözese ein und wurde gut einen Monat später, am 12. Dezember, Fest Unserer Lieben Frau von Guadalupe, in der Kathedrale St. Maria zum Bischof geweiht. Sein bischöfliches Motto lautet „In Illo uno unum“: Worte, die der heilige Augustinus in einer Predigt - der Auslegung von Psalm 127 - zitierte, um zu betonen, dass „wir Christen zwar viele sind, aber in dem einen Christus eins sind“.
Am 26. September 2015 wurde er von dem argentinischen Papst zum Bischof von Chiclayo ernannt, im März 2018 zum zweiten Vizepräsidenten der peruanischen Bischofskonferenz gewählt, in der er auch Mitglied des Wirtschaftsrats und Vorsitzender der Kommission für Kultur und Bildung war. Am 13. Juli 2019 wurde er von Franziskus in den Kreis der Mitglieder der Kongregation für den Klerus aufgenommen und im darauffolgenden Jahr zum Mitglied der Kongregation für die Bischöfe berufen. Am 15. April 2020 ernannte ihn der Papst auch zum Apostolischen Administrator der peruanischen Diözese Callao.
Am 30. Januar 2023 berief ihn Franziskus als Präfekt des Dikasteriums für die Bischöfe und Präsident der Päpstlichen Kommission für Lateinamerika nach Rom und ernannte ihn zum Erzbischof. Im Konsistorium vom 30. September desselben Jahres erhob er ihn schließlich zum Kardinal im Rang eines Kardinaldiakons und übertrug ihm als Titelkirche die Augustinerkirche in Rom, die der heiligen Monika geweiht ist. Robert Prevost nahm sie am 28. Januar 2024 in Besitz. Als Leiter des Dikasteriums nahm er an den letzten Apostolischen Reisen von Papst Franziskus sowie an der ersten und zweiten Sitzung der 16. ordentlichen Generalversammlung der Bischofssynode zur Synodalität teil, die vom 4. bis 29. Oktober 2023 bzw. vom 2. bis 27. Oktober 2024 in Rom stattfanden. Erfahrung in synodalen Versammlungen hatte er allerdings bereits in der Vergangenheit als Prior der Augustiner und Vertreter der Union der Generaloberen (UGS) gesammelt.
In der Zwischenzeit, am 4. Oktober 2023, wurde er von Franziskus zum Mitglied in verschiedenen Dikasterien berufen: Für die Evangelisierung (Sektion für die Neuevangelisierung und die neuen Teilkirchen); für die Glaubenslehre; für die orientalischen Kirchen; für den Klerus; für die Institute des geweihten Lebens und die Gesellschaften des Apostolischen Lebens; für Kultur und Bildung; für die Gesetzestexte; der Päpstlichen Kommission für den Staat der Vatikanstadt. Am 6. Februar 2025 schließlich erhob Papst Franziskus Robert Prevost zum Kardinalbischof des suburbikarischen Bistums Albano.
Während des letzten Krankenhausaufenthalts seines Vorgängers im „Gemelli“-Krankenhaus leitete Prevost am 3. März auf dem Petersplatz den Rosenkranz für die Gesundheit von Franziskus.